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土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書

點(diǎn)擊次數(shù)：1807 更新時(shí)間：2021-01-06

土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書

藥物概述及檢測(cè)原理

歐盟第675/92號(hào)令中初步規(guī)定在肌肉及牛奶中的四環(huán)素族化合物的總量不得超

過(guò)100ppb，在腎臟，肝臟及雞蛋中分別不得超過(guò)600 ppb，300 ppb及200ppb。

本公司的土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒使用生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等

特點(diǎn)。

本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)

包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和土霉素抗體，樣本土霉素藥物與固定在酶

標(biāo)板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)土霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時(shí)顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)

品（樣本）中土霉素藥物的含量成反比。

試劑盒內(nèi)包含組分：

10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。
96孔酶標(biāo)板：1塊
土霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
酶標(biāo)二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
20×濃縮復(fù)溶液：1瓶（10 mL/瓶）
底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
終止液：1瓶（7mL）
說(shuō)明書
蓋板膜

用戶需要自備的設(shè)備和試劑

儀器：

酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、630 nm）
電子天平（精度：0.01 g）
離心機(jī)（4000 g及以上）
生化培養(yǎng)箱（可調(diào)25℃、37℃、60℃）
旋渦振蕩器
微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
計(jì)時(shí)器

試劑：（試劑均為分析純）

去離子水

試劑盒特異性

　　　試劑盒與其他藥物的交叉反應(yīng)率：

土霉素…………………………100%
金霉素…………………………240%
四環(huán)素…………………………200%
強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）……………………20%

樣本檢測(cè)步驟

工作液準(zhǔn)備

復(fù)溶工作液：取1份20×濃縮復(fù)溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。

樣品前處理

組織樣本（稀釋倍數(shù)：12）

準(zhǔn)確稱取1±0.01 g均質(zhì)后的組織樣品于10 mL離心管中；
加入5 mL去離子水，劇烈渦動(dòng)2min；
4000 g以上，離心10 min；
取500ul上清液加入500ul復(fù)溶工作液（見(jiàn)5.1）中，渦動(dòng)10min；
取50ul進(jìn)行檢測(cè)。

蜂蜜樣本（稀釋倍數(shù)：10）

精que稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中；
加入2mL去離子水，充分渦動(dòng)1 min溶解分散；
取100ul溶解液加入400ul復(fù)溶工作液中，渦動(dòng)1 0S混勻；
立即取50ul進(jìn)行檢測(cè)。

液態(tài)奶樣本方法一（稀釋倍數(shù)：10）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）

將采樣好的液態(tài)奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
加入50μL 1M鹽酸（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；
取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入450μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
取50 μL液體進(jìn)行分析。

液態(tài)奶樣本方法二（稀釋倍數(shù)：40）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）

jing確量取50ul液態(tài)奶樣品于1950ul復(fù)溶工作液中；
充分渦動(dòng)1 min混勻；
立即取50ul進(jìn)行檢測(cè)。

飼料（牛飼料、豬飼料）（稀釋系數(shù)：200 ）

準(zhǔn)確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中；
加入 5 mL 去離子水，充分渦動(dòng) 2min 至飼料*分散；
4000 g 以上，離心 10 min；
取40 μL上清液于新的離心管中，加入1560μL 復(fù)溶工作液 ，充分渦動(dòng) 30 s；
立即取 50μL 進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)

準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測(cè)值波動(dòng)建議做雙孔平行實(shí)驗(yàn)（每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；
標(biāo)準(zhǔn)品工作液配制：分別取5個(gè)2ml離心管，標(biāo)記為0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；于每個(gè)管中加入900ul復(fù)溶工作液，于對(duì)應(yīng)管中加入100ul10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；
加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；
孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)30 min；
洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；
顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；
孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；
終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。
讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長(zhǎng)讀取酶標(biāo)板吸光度值。

計(jì)算結(jié)果

設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比：
使用半對(duì)數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測(cè)物含量。